作者 胡明倩 马鞍山市含山县桥联卫生所

　　【摘要】本实验目的为，测试抗肿瘤药物多西他赛诱导肿瘤相关成纤维细胞（CAF）凋亡的效果，以及对机体自身免疫细胞活性的影响。实验用到小鼠脾细胞、CAFs、多西他赛及其他试剂和培养基，使用流式细胞术和MTT法检测细胞成活情况。实验发现，脾细胞数量无明显变化，而CAFs大量减少，从而得出多西他赛对于脾细胞毒性较弱，对CAFs影响较大，可以诱导CAF晚期凋亡。

　　【关键词】

　　药物疗法；多西他赛；流式细胞术；肿瘤相关成纤维细胞；免疫细胞

　　【前言】

　　多西他赛（Docetaxel）是一种紫杉醇类抗肿瘤药，通过干扰正常微管束的形成和固定抑制肿瘤细胞的有丝分裂过程，现被应用于乳腺癌、卵巢癌等多种癌症的临床治疗。肿瘤间质是肿瘤赖以生存的环境，其中一个主要组成成分，肿瘤相关成纤维细胞（Cancer-associatedfibroblasts,CAFs）可产生一些因子，其有助于肿瘤细胞的转移、侵袭和生长，肿瘤附近血管的生成、浸润和转移等过程。[1-3]本实验针对多西他赛对于CAFs的杀伤作用进行研究，探讨多西他赛能否用于破坏肿瘤微环境从而治疗癌症，同时检测该药物对机体自身免疫细胞的影响，讨论其用于临床治疗安全性。

　　1材料与方法

　　1.1主要材料

　　细胞培养版、离心机、显微镜、培养箱、流式细胞仪、酶标仪；小鼠、CAF、多西他赛、1640培养基、DEME培养基、MTT、三联溶解液、CD4染剂、CD8染剂、AnnexinV试剂、PI染料（碘化丙啶）

　　1.2方法

　　1.2.1获取细胞悬液断颈迅速处死一只小鼠，取出脾脏，用含10%胎牛血清的1640培养基制成脾细胞悬液。将原细胞悬液稀释100倍后用细胞计数板计数，计算出脾细胞总数。取一块CAFs培养皿，弃上清，用DEME培养基制成CAFs细胞悬液。将其稀释20倍后用细胞计数板计数，计算出细胞总数。

　　1.2.2实验分组分为CAF流式培养组（CAFs1组）、CAFMTT培养组（CAFs2组）、脾细胞流式培养组（T1组）、脾细胞MTT组（T2组）。

　　1.2.3脾细胞铺板计算所需细胞液和1640培养基的体积。

　　1.2.4CAFs铺板计算所需细胞液和DEME培养基的体积

　　1.2.5MTT法检测脾细胞和CAFs活性

　　1.2.6流式细胞术检测细胞和CAFs活性

　　1.3统计学处理

　　采用SPSS软件进行统计学分析，所有计量数值进行正态性检验，均为正态分布。

　　2实验结果

　　2.1多西他赛对机体自身免疫细胞的影响

　　向等量免疫细胞中加入不同浓度（0μg/ml、0.4μg/ml、4.0μg/ml）的多西他赛，培养24h后用流式细胞术和MTT法检测细胞活性。结果显示，随多西他赛浓度上升，CD4-T细胞和CD8-T细胞占比均呈上升趋势。见图1。

　　2.2多西他赛对CAFs的影响

　　向等量CAFs中加入不同浓度（0μg/ml、0.4μg/ml、4.0μg/ml）的多西他赛，培养24h后用流式细胞术和MTT法检测细胞活性。结果显示，随多西他赛浓度上升，CAFs早期凋亡比例增加。见图2。

　　3讨论

　　目前为止，临床治疗中应用的多西他赛，主要依靠破坏肿瘤细胞的微管网络抑制癌细胞生长。但耐药性的产生使得多西他赛疗法还需进一步改善。肿瘤微环境（tumormicroenvironment）由肿瘤细胞和肿瘤间质组成，其对肿瘤的形态、结构和生理功能的作用正在被逐步认知。通过影响肿瘤间质的重要组成部分之一，肿瘤相关成纤维细胞，从而治疗肿瘤的想法也被提出。本实验发现，多西他赛可影响CAFs的早期凋亡过程，减少对肿瘤细胞的供能，从而治疗肿瘤。

　　参考文献

　　[1]JiangH，HegdeS，DeNardoDG.Tumor-asociatedfi-brosisasaregulatoroftumorimmunity
andresponsetoimmunotherapy[J].CancerImmunolImmunother，2017，66(8):1037-1048.

　　[2]LiaoZ，TanZW，ZhuP，etal.Cancer-asociatedfibro-

　　blastsintumormicroenvironment-Acomplicesintumormalignancy[J].Ce
lImmunol，2018，pi:S0008-8749(17)30222-8.

　　[3]NazarethMR,BroerickL,Simpson-AbelsonJR,etal.Charater-izationo
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ationoftumor-associatedTcells[J].JIm-munol,2007,178（9）:5552-5562.